RAPPORTO DI REVISIONE CORMAN-DROSTEN ET AL. EUROSURVEILLANCE 2020

Questo ampio rapporto di revisione è stato ufficialmente presentato al comitato editoriale di Eurosurveillance il 27 novembre 2020 tramite il loro portale di presentazione, allegata a questo rapporto di revisione è una lettera di richiesta di ritrattazione , firmata da tutti i principali e coautori. Il primo e l’ultimo nome elencati sono il primo e il secondo autore principale. Tutti i nomi intermedi sono coautori.

La revisione paritaria esterna del test RT-PCR per rilevare SARS-CoV-2 rivela 10 principali difetti scientifici a livello molecolare e metodologico: conseguenze per risultati falsi positivi.

Pieter Borger (1) , Bobby Rajesh Malhotra (2) , Michael Yeadon (3) , Clare Craig (4) , Kevin McKernan (5) , Klaus Steger (6) , Paul McSheehy (7) , Lidiya Angelova (8) , Fabio Franchi (9) , Thomas Binder (10) , Henrik Ullrich (11) , Makoto Ohashi (12) , Stefano Scoglio (13) , Marjolein Doesburg-van Kleffens (14) , Dorothea Gilbert (15) , Rainer Klement (16) , Ruth Schruefer (17) , Berber W. Pieksma (18), Jan Bonte (19) , Bruno H. Dalle Carbonare (20) , Kevin P. Corbett (21) , Ulrike Kämmerer (22)

ASTRATTO

Nella pubblicazione intitolata “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR” (Eurosurveillance 25 (8) 2020) gli autori presentano un flusso di lavoro diagnostico e protocollo RT-qPCR per il rilevamento e la diagnostica del 2019-nCoV (ora noto come SARS-CoV-2), che sostengono di essere convalidato, oltre ad essere una solida metodologia diagnostica per l’uso in ambienti di laboratorio di sanità pubblica. 

Alla luce di tutte le conseguenze derivanti da questa stessa pubblicazione per le società di tutto il mondo, un gruppo di ricercatori indipendenti ha eseguito una revisione punto per punto della suddetta pubblicazione in cui 1) tutti i componenti del progetto di test presentato sono stati sottoposti a controlli incrociati, 2) il Le raccomandazioni del protocollo RT-qPCR sono state valutate rispetto alla buona pratica di laboratorio e 3) i parametri sono stati esaminati rispetto alla letteratura scientifica pertinente che copre il campo. 

Il protocollo RT-qPCR pubblicato per il rilevamento e la diagnostica di 2019-nCoV e il manoscritto soffrono di numerosi errori tecnici e scientifici, tra cui un design del primer insufficiente, un protocollo RT-qPCR problematico e insufficiente e l’assenza di una convalida accurata del test. Né il test presentato né il manoscritto stesso soddisfano i requisiti per una pubblicazione scientifica accettabile. Inoltre, non vengono menzionati gravi conflitti di interesse degli autori. Infine, il brevissimo lasso di tempo tra la presentazione e l’accettazione della pubblicazione (24 ore) significa che un processo sistematico di revisione tra pari non è stato eseguito qui o di scarsa qualità problematica. Forniamo prove convincenti di numerose inadeguatezze, errori e difetti scientifici.

Considerando le imperfezioni scientifiche e metodologiche qui presentate, siamo fiduciosi che il comitato editoriale di Eurosurveillance non abbia altra scelta che ritirare la pubblicazione.

RAPPORTO DI REVISIONE CONCISO

Questo documento mostrerà numerosi gravi difetti nel documento Corman-Drosten, il cui significato ha portato a diagnosi errate in tutto il mondo di infezioni attribuite a SARS-CoV-2 e associate alla malattia COVID-19. Siamo di fronte a severi blocchi che hanno distrutto la vita e il sostentamento di molte persone, l’accesso limitato all’istruzione e queste restrizioni imposte dai governi di tutto il mondo sono un attacco diretto ai diritti fondamentali delle persone e alle loro libertà personali, con conseguenti danni collaterali per intere economie su un scala globale.

Ci sono dieci problemi fatali con il documento Corman-Drosten che descriveremo e spiegheremo in maggior dettaglio nelle sezioni seguenti.

Il primo e principale problema è che il romanzo Coronavirus SARS-CoV-2 (nella pubblicazione denominata 2019-nCoV e nel febbraio 2020 denominato SARS-CoV-2 da un consorzio internazionale di esperti di virus) è basato su sequenze in silico (teoriche) , fornito da un laboratorio in Cina [1], perché all’epoca né il materiale di controllo del SARS-CoV-2 infettivo (“vivo”) o inattivato né l’RNA genomico isolato del virus erano a disposizione degli autori. Ad oggi nessuna convalida è stata eseguita dall’autore sulla base di virus SARS-CoV-2 isolati o di loro RNA a lunghezza intera. Secondo Corman et al .:

“Abbiamo mirato a sviluppare e implementare una solida metodologia diagnostica da utilizzare in ambienti di laboratorio di sanità pubblica senza avere a disposizione materiale virale”. [1]

L’attenzione qui dovrebbe essere posta sui due obiettivi dichiarati: a) sviluppo eb) implementazione di un test diagnostico da utilizzare in ambienti di laboratorio di sanità pubblica . Questi obiettivi non sono raggiungibili senza avere a disposizione materiale virale effettivo (ad esempio per determinare la carica virale infettiva). In ogni caso, solo un protocollo con la massima precisione può essere l’obiettivo primario e obbligatorio in qualsiasi scenario-esito di questa portata. La determinazione della carica virale critica è un’informazione obbligatoria ed è responsabilità del gruppo di Christian Drosten eseguire questi esperimenti e fornire i dati cruciali.

Tuttavia queste sequenze in silico sono state utilizzate per sviluppare una metodologia di test RT-PCR per identificare il suddetto virus. Questo modello si basava sul presupposto che il nuovo virus fosse molto simile al SARS-CoV del 2003 poiché entrambi sono beta-coronavirus.

Il test PCR è stato quindi progettato utilizzando la sequenza genomica di SARS-CoV come materiale di controllo per il componente Sarbeco; lo sappiamo dalla nostra comunicazione e-mail personale con [2] uno dei coautori dell’articolo Corman-Drosten. Questo metodo per modellare SARS-CoV-2 è stato descritto nel documento Corman-Drosten come segue:

“ L’istituzione e la convalida di un flusso di lavoro diagnostico per lo screening 2019-nCoV e la conferma specifica, progettato in assenza di isolati di virus disponibili o di campioni di pazienti originali. La progettazione e la convalida sono state rese possibili dalla stretta parentela genetica con la SARS-CoV del 2003 e aiutate dall’uso della tecnologia degli acidi nucleici sintetici “.

La reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) è un’importante tecnologia biomolecolare per rilevare rapidamente frammenti di RNA rari, noti in anticipo. Nella prima fase, le molecole di RNA presenti nel campione vengono trascritte inversamente per produrre cDNA. Il cDNA viene quindi amplificato nella reazione a catena della polimerasi utilizzando una coppia di primer specifica e un enzima DNA polimerasi termostabile. La tecnologia è altamente sensibile e il suo limite di rilevamento è teoricamente 1 molecola di cDNA. La specificità della PCR è fortemente influenzata da errori di progettazione biomolecolare.

Cosa è importante quando si progetta un test RT-PCR e il test quantitativo RT-qPCR descritto nella pubblicazione Corman-Drosten?

1. I primer e le sonde:

a) la concentrazione di primer e sonde deve essere del range ottimale
(100-200 nM)
b) deve essere specifica per il gene target che si desidera amplificare
c) deve avere una percentuale ottimale di contenuto di GC rispetto alle basi azotate totali ( minimo 40%, massimo 60%)
d) per la diagnostica virale almeno 3 coppie di primer devono rilevare 3 geni virali (preferibilmente il più distanti possibile nel genoma virale)

2. La temperatura alla quale avvengono tutte le reazioni:

a) Temperatura di fusione del DNA (> 92 °)
b) Temperatura di amplificazione del DNA (TaqPol specifica)
c) Tm; la temperatura di annealing (la temperatura alla quale i primer e le sonde raggiungono il legame / distacco target, non deve superare i 2 ̊C per coppia di primer). Tm dipende fortemente dal contenuto GC dei primer

3. Il numero di cicli di amplificazione (inferiore a 35; preferibilmente 25-30 cicli);

In caso di rilevamento di virus,> 35 cicli rilevano solo segnali che non sono correlati al virus infettivo come determinato dall’isolamento in coltura cellulare [rivisto in 2]; se qualcuno viene testato dalla PCR come positivo quando viene utilizzata una soglia di 35 cicli o superiore (come nel caso della maggior parte dei laboratori in Europa e negli Stati Uniti), la probabilità che tale persona sia effettivamente infetta è inferiore al 3%, la probabilità che detto risultato è un falso positivo è del 97% [rivisto in 3]

4. Validazioni biologiche molecolari; I prodotti PCR amplificati devono essere convalidati eseguendo i prodotti in un gel con un righello del DNA o mediante sequenziamento diretto del DNA

5. È necessario specificare controlli positivi e negativi per confermare / rifiutare il rilevamento di virus specifici

6. Dovrebbe essere disponibile una procedura operativa standard (SOP)

SOP specifica inequivocabilmente i parametri di cui sopra, in modo che tutti i laboratori siano in grado di impostare le stesse identiche condizioni di prova. Avere un SOP universale convalidato è essenziale, perché consente il confronto dei dati all’interno e tra i paesi.

MINORI PREOCCUPAZIONI CON IL DOCUMENTO CORMAN-DROSTEN

1. Nella tabella 1 del documento Corman-Drosten, sono indicate diverse abbreviazioni – “nM” è specificato, “nm” no. Inoltre, per quanto riguarda la nomenclatura corretta, nm significa “nanometro” quindi nm dovrebbe leggere nM qui.

2. È consenso generale scrivere sequenze genetiche sempre nella direzione 5′-3 ‘, inclusi i primer inversi. È molto insolito eseguire l’allineamento con la scrittura complementare inversa della sequenza di primer come hanno fatto gli autori nella figura 2 dell’articolo Corman-Drosten. Qui, inoltre, una base oscillante è contrassegnata come “y” senza descrizione delle basi per cui Y sta.

3. Due insidie ​​fuorvianti nel documento Corman-Drosten sono che la loro tabella 1 non include i valori Tm (valori della temperatura di ricottura), né mostra i valori GC (numero di G e C nelle sequenze come valore% di basi totali).

PRINCIPALI PREOCCUPAZIONI CON IL DOCUMENTO CORMAN-DROSTEN

UN SOTTOFONDO

Gli autori introducono il background del loro lavoro scientifico come: “L’epidemia in corso del nuovo coronavirus emerso di recente (2019-nCoV) rappresenta una sfida per i laboratori di sanità pubblica poiché gli isolati di virus non sono disponibili mentre vi sono prove crescenti che l’epidemia è più diffusa di inizialmente pensato, e la diffusione internazionale attraverso i viaggiatori già avviene ”.

Secondo BBC News [4] e Google Statistics [5] ci sono stati 6 morti in tutto il mondo il 21 gennaio 2020, il giorno in cui è stato presentato il manoscritto. Perché gli autori hanno assunto una sfida per i laboratori di sanità pubblica mentre non c’erano prove sostanziali in quel momento per indicare che l’epidemia fosse più diffusa di quanto inizialmente pensato?

Come obiettivo, gli autori hanno dichiarato di sviluppare e implementare una solida metodologia diagnostica da utilizzare in ambienti di laboratorio di sanità pubblica senza avere a disposizione materiale virale. Inoltre, riconoscono che “Il presente studio dimostra l’enorme capacità di risposta raggiunta attraverso il coordinamento dei laboratori accademici e pubblici nelle reti di ricerca nazionali ed europee”.

B) METODI E RISULTATI

1. Progettazione di primer e sonda

1a) Concentrazioni di primer errate

I protocolli di test PCR affidabili e precisi sono normalmente progettati utilizzando tra 100 nM e 200 nM per primer [7]. Nel documento Corman-Drosten, osserviamo concentrazioni di primer insolitamente elevate e variabili per diversi primer (tabella 1). Per le coppie di primer RdRp_SARSr-F e RdRp_SARSr-R, vengono descritti rispettivamente 600 nM e 800 nM. Allo stesso modo, per il set di primer N_Sarbeco_F e N_Sarbeco_R, consigliano rispettivamente 600 nM e 800 nM [1].

Dovrebbe essere chiaro che queste concentrazioni sono troppo elevate per essere ottimali per specifiche amplificazioni di geni bersaglio. Non esiste alcun motivo specifico per utilizzare queste concentrazioni estremamente elevate di primer in questo protocollo. Piuttosto, queste concentrazioni portano ad un aumento del legame aspecifico e all’amplificazione del prodotto PCR.


Tabella 1: Primer e sonde (adattato dal documento Corman-Drosten; sono evidenziate concentrazioni di primer errate)

1b) Sequenze di primer e sonda non specificate (“oscillanti”)

Per ottenere risultati riproducibili e confrontabili, è essenziale definire distintamente le coppie di primer. Nell’articolo Corman-Drosten abbiamo osservato sei posizioni non specificate, indicate dalle lettere R, W, M e S (Tabella 2). La lettera W significa che in questa posizione può esserci una A o una T; R significa che ci può essere una G o una A; M indica che la posizione può essere una A o una C; la lettera S indica che ci può essere una G o una C in questa posizione.

Questo elevato numero di varianti non solo è insolito, ma crea anche molta confusione per i laboratori. Queste sei posizioni non specificate potrebbero facilmente portare alla progettazione di diverse sequenze di primer alternative che non si riferiscono a SARS-CoV-2 (2 primer RdRp_SARSr_F distinti + 8 sonde RdRp_SARS_P1 distinte + 4 RdRp_SARSr_R distinti).Le variazioni di progettazione porteranno inevitabilmente a risultati che non sono nemmeno correlati alla SARS CoV-2. Pertanto, la descrizione aspecifica confusa nel documento Corman-Drosten non è adatta come protocollo operativo standard. Queste posizioni non specificate avrebbero dovuto essere progettate in modo inequivocabile.

Queste sequenze traballanti hanno già creato una fonte di preoccupazione nel campo e hanno portato a una lettera all’editore scritta da Pillonel et al. [8] per quanto riguarda gli errori palesi nelle sequenze descritte. Questi errori sono evidenti nel documento Corman et al. supplemento pure.


Tabella 2: Primer e sonde (adattati dal documento Corman-Drosten; sono evidenziati i nucleotidi non specificati (“traballanti”) nei primer)

Il protocollo WHO (Figura 1), che deriva direttamente dal documento Corman-Drosten, conclude che per confermare la presenza di SARS-CoV-2, devono essere identificati due geni di controllo (i geni E e RdRp) nel dosaggio. Va notato che il gene RdPd ha una posizione incerta (“traballante”) nel forward primer (R = G / A), due posizioni incerte nel reverse primer (R = G / A; S = G / C) e ha tre posizioni incerte nella sonda RdRp (W = A / T; R = G / A; M = A / C). Quindi, due diversi primer diretti, quattro diversi primer inversi e otto sonde distinte possono essere sintetizzati per il gene RdPd. Insieme, ci sono 64 possibili combinazioni di primer e sonde!

Il documento Corman-Drosten identifica ulteriormente un terzo gene che, secondo il protocollo dell’OMS, non è stato ulteriormente convalidato e ritenuto non necessario:

“Da notare, anche il test del gene N ha funzionato bene, ma non è stato sottoposto a un’ulteriore convalida intensiva perché era leggermente meno sensibile”.

Questa è stata una sfortunata omissione in quanto sarebbe stato meglio utilizzare tutte e tre le PCR geniche come test di conferma e ciò avrebbe portato a un protocollo di strumento diagnostico per il rilevamento dell’RNA del virus quasi sufficiente. Tre passaggi del test di conferma minimizzerebbero almeno gli errori e le incertezze in ogni passaggio di piegatura per quanto riguarda i punti “traballanti”. (Tuttavia, il protocollo sarebbe ancora al di sotto di qualsiasi “buona pratica di laboratorio”, quando si tiene conto di tutti gli altri errori di progettazione).

Allo stato attuale, il test del gene N non è purtroppo né proposto nella raccomandazione dell’OMS (Figura 1) come un terzo passaggio di conferma obbligatorio e cruciale, né è enfatizzato nel documento Corman-Drosten come importante rassicurazione opzionale “per un flusso di lavoro di routine” (Tavolo 2).

Di conseguenza, in quasi tutte le procedure di test in tutto il mondo, sono state utilizzate solo 2 corrispondenze di primer invece di tutte e tre. Questa svista rende l’intero protocollo di test inutile per quanto riguarda la fornitura di risultati di test accurati di reale importanza in una pandemia in corso.

Figura 1: Il test di conferma N-Gene non è né enfatizzato come terzo passaggio necessario nella raccomandazione ufficiale del protocollo Drosten-Corman dell’OMS di seguito [8] né è richiesto come passaggio cruciale per una maggiore accuratezza del test nella pubblicazione di Eurosurveillance.

1c) Contenuto GC errato (discusso in 2c, insieme alla temperatura di annealing (Tm))

1d) Rilevazione di geni virali

RT-PCR non è raccomandato per la diagnostica primaria dell’infezione. Questo è il motivo per cui il test RT-PCR utilizzato nella routine clinica per il rilevamento di COVID-19 non è indicato per la diagnosi di COVID-19 su base normativa.

“I medici devono riconoscere la maggiore accuratezza e velocità delle tecniche di diagnostica molecolare per la diagnosi delle infezioni, ma anche comprenderne i limiti. I risultati di laboratorio devono sempre essere interpretati nel contesto della presentazione clinica del paziente e sono necessari un sito, una qualità e un momento appropriati per la raccolta dei campioni per risultati affidabili dei test ”. [9]

Tuttavia, può essere utilizzato per aiutare il medico nella diagnosi differenziale quando deve discriminare tra diverse infezioni del polmone (influenza, Covid-19 e SARS hanno sintomi molto simili). Per una diagnosi di conferma di un virus specifico, è necessario applicare almeno 3 coppie di primer specifiche per rilevare 3 geni specifici del virus. Preferibilmente, questi geni bersaglio dovrebbero essere localizzati con la massima distanza possibile nel genoma virale (estremità opposte incluse).

Sebbene il documento Corman-Drosten descriva 3 primer, questi primer coprono solo circa la metà del genoma del virus. Questo è un altro fattore che riduce la specificità per il rilevamento dell’RNA del virus COVID-19 intatto e aumenta la quota di risultati falsi positivi.

Pertanto, anche se otteniamo tre segnali positivi (cioè le tre coppie di primer danno 3 diversi prodotti di amplificazione) in un campione, ciò non prova la presenza di un virus. Un design migliore dei primer avrebbe primer terminali su entrambe le estremità del genoma virale. Questo perché l’intero genoma virale sarebbe coperto e tre segnali positivi possono discriminare meglio tra un virus completo (e quindi potenzialmente infettivo) e genomi virali frammentati (senza potenza infettiva).Per dedurre qualcosa di significativo sull’infettività del virus, il gene Orf1, che codifica l’enzima replicasi essenziale dei virus SARS-CoV, avrebbe dovuto essere incluso come bersaglio (Figura 2). Il posizionamento dei bersagli nella regione del genoma virale che è trascritto in modo più pesante e variabile è un altro punto debole del protocollo.

Kim et al. dimostrano un’espressione 3 ‘altamente variabile di RNA subgenomico in Sars-CoV-2 [23]. Questi RNA vengono monitorati attivamente come firme per pazienti asintomatici e non infettivi [10]. È altamente discutibile esaminare una popolazione di persone asintomatiche con primer qPCR che hanno 6 coppie di basi primer-dimero sull’estremità 3 prime di un primer (Figura 3).
Apparentemente l’OMS raccomanda questi primer. Abbiamo testato tutti i derivati ​​del wobble dalla carta Corman-Drosten con lo strumento web primer dimer di Thermofisher [11]. Il primer in avanti RdRp ha un’omologia di 6bp 3prime con Sarbeco E Reverse. Ad alte concentrazioni di primer questo è sufficiente per creare imprecisioni.

Da notare: esiste una corrispondenza perfetta di uno degli inneschi N con un patogeno clinico (Pantoea), trovato in pazienti immunocompromessi. Il primer inverso colpisce anche Pantoea ma non nella stessa regione (Figura 3).

Si tratta di gravi errori di progettazione, poiché il test non può discriminare tra l’intero virus e i frammenti virali. Il test non può essere utilizzato come diagnosi per i virus della SARS.

Figura 2: posizioni relative dei bersagli degli ampliconi sul coronavirus SARS e sul genoma del nuovo coronavirus del 2019. ORF: cornice di lettura aperta; RdRp: RNA polimerasi RNA-dipendente. I numeri sotto l’amplicon sono posizioni del genoma secondo SARS-CoV, NC_004718 [1];

Figura 3: Un test con lo strumento web primer dimer di Thermofischer rivela che il primer in avanti RdRp ha un’omologia di 6bp 3`prime con Sarbeco E Reverse (riquadro a sinistra). Un altro test rivela che esiste una corrispondenza perfetta per uno degli N-primer con un patogeno clinico (Pantoea) trovato in pazienti immunocompromessi (riquadro a destra).

2. Temperature di reazione

2a) Temperatura di fusione del DNA (> 92 °).

Adeguatamente affrontato nel documento Corman-Drosten.

2b) Temperatura di amplificazione del DNA.

Adeguatamente affrontato nel documento Corman-Drosten.

2c) Contenuti GC errati e Tm

La temperatura di ricottura determina a quale temperatura il primer si attacca / si stacca dalla sequenza target. Per un’amplificazione efficiente e specifica, il contenuto GC dei primer deve soddisfare un minimo del 40% e un massimo del 60% di amplificazione. Come indicato nella tabella 3, tre dei primer descritti nel documento Corman-Drosten non rientrano nell’intervallo normale per il contenuto di GC. Due primer (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R) hanno valori GC insoliti e molto bassi del 28% -31% per tutte le possibili varianti di basi oscillanti, mentre il primer E_Sarbeco_F ha un valore GC del 34,6% (Tabella 3 e secondo pannello della Tabella 3) .

Va notato che il contenuto di GC determina in gran parte il legame al suo target specifico a causa dei suoi tre legami idrogeno nell’accoppiamento di basi. Pertanto, minore è il contenuto di GC del primer, minore è la sua capacità di legarsi alla sua specifica sequenza genica bersaglio (cioè il gene da rilevare). Ciò significa che per riconoscere una sequenza target dobbiamo scegliere una temperatura il più vicino possibile alla temperatura di ricottura effettiva (valore di best practice) affinché il primer non si stacchi nuovamente, selezionando allo stesso tempo specificatamente il sequenza di destinazione.

Se il valore Tm è molto basso, come osservato per tutte le varianti traballanti dei primer inversi RdRp, i primer possono legarsi in modo non specifico a diversi target, diminuendo la specificità e aumentando i potenziali risultati falsi positivi.

La temperatura di annealing (Tm) è un fattore cruciale per la determinazione della specificità / accuratezza della procedura qPCR ed essenziale per valutare l’accuratezza dei protocolli qPCR. Raccomandazione di best practice: entrambi i primer (avanti e indietro) dovrebbero avere un valore quasi simile, preferibilmente lo stesso valore.

Abbiamo utilizzato il software di progettazione di primer disponibile gratuitamente Primer-BLAST [12, 25] per valutare i valori di best practice per tutti i primer utilizzati nel documento Corman-Drosten (Tabella 3). Abbiamo tentato di trovare un valore Tm di 60 ° C, cercando allo stesso tempo il valore GC% più alto possibile per tutti i primer. Una differenza Tm massima di 2 ° C all’interno delle coppie di primer è stata considerata accettabile. Testando le coppie di primer specificate nel documento Corman-Drosten, abbiamo osservato una differenza di 10 ° C rispetto alla temperatura di annealing Tm per la coppia di primer1 (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R). Questo è un errore molto grave e rende il protocollo inutile come strumento diagnostico specifico.

Ulteriori test hanno dimostrato che solo la coppia di primer progettata per amplificare il gene N (N_Sarbeco_F e N_Sarbeco_R) ha raggiunto lo standard adeguato per operare in un test diagnostico, poiché ha un contenuto di GC sufficiente e la differenza Tm tra i primer (N_Sarbeco_F e N_Sarbeco_R ) è 1,85 ° C (al di sotto del massimo cruciale di 2 ° C di differenza). È importante sottolineare che questo è il gene che non è stato né testato nei campioni di virus (Tabella 2) né sottolineato come test di conferma. Oltre alle temperature di fusione altamente variabili e alle sequenze degenerate in questi primer, c’è un altro fattore che influisce sulla specificità della procedura: i dNTP (0.4uM) sono 2 volte superiori a quelli raccomandati per un’amplificazione altamente specifica. Viene aggiunto anche solfato di magnesio aggiuntivo alla reazione.Questa procedura combinata con una bassa temperatura di annealing può creare amplificazioni non specifiche. Quando è necessario ulteriore magnesio per qPCR, la specificità del dosaggio deve essere ulteriormente esaminata.

Gli errori di progettazione qui descritti sono così gravi che è altamente improbabile che si verifichi un’amplificazione specifica del materiale genetico SARS-CoV-2 utilizzando il protocollo del documento Corman-Drosten.

Tabella 3: contenuto GC dei primer e delle sonde (adattato dal documento Corman-Drosten; sono evidenziate le aberrazioni dai contenuti GC ottimizzati. Il secondo pannello mostra una tabella che elenca tutti i valori delle migliori pratiche di Primer-BLAST per tutti i primer e le sonde utilizzati in il documento Corman-Drosten del Prof. Dr. Ulrike Kämmerer e il suo team

3. Il numero di cicli di amplificazione

Va notato che non vi è alcuna menzione da nessuna parte nel documento Corman-Drosten di un test positivo o negativo, o addirittura di ciò che definisce un risultato positivo o negativo. Questi tipi di test diagnostici virologici devono essere basati su una SOP, compreso un numero di cicli PCR convalidato e fisso (valore Ct) dopo il quale un campione è considerato positivo o negativo. Il valore Ct ragionevolmente affidabile massimo è di 30 cicli. Al di sopra di un Ct di 35 cicli, ci si deve aspettare un numero in rapido aumento di falsi positivi.

I dati della PCR valutati come positivi dopo un valore Ct di 35 cicli sono completamente inaffidabili.

Citando Jaafar et al. 2020 [3]: “A Ct = 35, il valore che abbiamo utilizzato per segnalare un risultato positivo per PCR, <3% delle colture è positivo.” In altre parole, non è stato possibile isolare con successo il virus di SARS-CoV-2 a quei valori Ct elevati.

Inoltre, studi scientifici dimostrano che vengono rilevati solo virus non infettivi (morti) con valori Ct di 35 [22].

Tra 30 e 35 c’è una zona grigia, dove non è possibile stabilire con certezza un test positivo. Questa zona dovrebbe essere esclusa. Naturalmente, si potrebbero eseguire 45 cicli di PCR, come raccomandato nel protocollo Corman-Drosten WHO (Figura 4), ma poi è necessario definire anche un valore Ct ragionevole (che non dovrebbe superare i 30). Ma un risultato analitico con un valore Ct di 45 è scientificamente e diagnosticamente assolutamente privo di significato (un valore Ct ragionevole non dovrebbe superare 30). Tutto ciò dovrebbe essere comunicato in modo molto chiaro. È un errore significativo che il documento Corman-Drosten non menzioni il valore Ct massimo al quale un campione può essere considerato inequivocabilmente come risultato del test positivo o negativo. Anche questo importante limite di soglia del ciclo non è specificato nelle comunicazioni di follow-up fino ad oggi.

Figura 4: Raccomandazione del kit RT-PCR nel protocollo ufficiale Corman-Drosten WHO [8]. È possibile trovare solo un valore “Cycler” (cicli) senza Ct (valore di cutoff) corrispondente e scientificamente ragionevole. Questo o qualsiasi altro valore di cicli non si trova da nessuna parte nell’attuale articolo di Corman-Drosten.

4. Validazioni biomolecolari

Per determinare se i prodotti amplificati sono effettivamente geni SARS-CoV-2, la convalida biomolecolare dei prodotti PCR amplificati è essenziale. Per un test diagnostico, questa convalida è un must assoluto.

La convalida dei prodotti della PCR deve essere eseguita eseguendo il prodotto della PCR in un gel di agarosio-EtBr all’1% insieme a un indicatore delle dimensioni (righello del DNA o scala del DNA) in modo che la dimensione del prodotto possa essere stimata. La dimensione deve corrispondere alla dimensione calcolata del prodotto di amplificazione. Ma è ancora meglio sequenziare il prodotto di amplificazione. Quest’ultimo darà il 100% di certezza sull’identità del prodotto di amplificazione. Senza la validazione molecolare non si può essere sicuri dell’identità dei prodotti PCR amplificati. Considerando i gravi errori di progettazione descritti in precedenza, i prodotti PCR amplificati possono essere qualsiasi cosa.

Inoltre non menzionato nel documento Corman-Drosten è il caso di piccoli frammenti di qPCR (circa 100 bp): potrebbe essere gel di agarosio all’1,5% o anche un gel di acrilammide.

Il fatto che questi prodotti PCR non siano stati convalidati a livello molecolare è un altro eclatante errore del protocollo, che rende inutile qualsiasi test basato su di esso come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.

5. Controlli positivi e negativi per confermare / rifiutare il rilevamento di virus specifici.

L’ipotesi non confermata descritta nel documento Corman-Drosten è che SARS-CoV-2 è l’unico virus del gruppo beta-coronavirus simile alla SARS che attualmente causa infezioni negli esseri umani. Le sequenze su cui si basa il loro metodo PCR sono sequenze in silico, fornite da un laboratorio in Cina [23], perché al momento dello sviluppo del test PCR nessun materiale di controllo di SARS-CoV- infettivo (“vivo”) o inattivato 2 era a disposizione degli autori. Il test PCR è stato quindi progettato utilizzando la sequenza del noto SARS-CoV come materiale di controllo per il componente Sarbeco (Dr. Meijer, coautore dell’articolo Corman-Drosten in uno scambio di e-mail con il Dr. Peter Borger) [2].

Tutti gli individui risultati positivi al test RT-PCR, come descritto nel documento Corman-Drosten, sono considerati positivi per le infezioni SARS-CoV-2. Ci sono tre gravi difetti nella loro ipotesi. In primo luogo, un test positivo per le molecole di RNA descritte nel documento Corman-Drosten non può essere equiparato a “infezione da virus”. Un test RT-PCR positivo indica semplicemente la presenza di molecole di RNA virale. Come dimostrato al punto 1d (sopra), il test Corman-Drosten non è stato progettato per rilevare il virus a lunghezza intera, ma solo un frammento del virus. Abbiamo già concluso che questo classifica il test come inadatto come test diagnostico
per le infezioni da virus della SARS.

In secondo luogo e di grande rilevanza, la funzionalità del test RT-PCR pubblicato non è stata dimostrata con l’uso di un controllo positivo (RNA SARS-CoV-2 isolato) che è un gold standard scientifico essenziale.

In terzo luogo, il documento Corman-Drosten afferma:

“Per dimostrare che i test possono rilevare altri virus correlati alla SARS associati ai pipistrelli, abbiamo utilizzato il test del gene E per testare sei campioni fecali derivati ​​dai pipistrelli disponibili da Drexler et al. […] Und Muth et al. […]. Questi campioni positivi al virus provenivano da pipistrelli rinolofidi europei. Il rilevamento di questi valori anomali filogenetici all’interno del clade CoV correlato alla SARS suggerisce che è probabile che vengano rilevati tutti i virus asiatici. Ciò, in teoria, garantirebbe un’ampia sensibilità anche in caso di acquisizioni multiple indipendenti di virus varianti da un serbatoio animale “.

Questa affermazione dimostra che il gene E utilizzato nel test RT-PCR, come descritto nel documento Corman-Drosten, non è specifico per SARS-CoV-2.

I primer del gene E rilevano anche un ampio spettro di altri virus della SARS.
Il genoma del coronavirus è il più grande di tutti i virus a RNA che infettano gli esseri umani e hanno tutti una struttura molecolare molto simile. Tuttavia, SARS-CoV1 e SARS-CoV-2 hanno due impronte genetiche altamente specifiche, che li distinguono dagli altri coronavirus. Innanzitutto, una sequenza di impronte digitali unica (KTFPPTEPKKDKKKK) è presente nella proteina N di SARS-CoV e SARS-CoV-2 [13,14,15]. In secondo luogo, sia SARS-CoV1 che SARS-CoV2 non contengono la proteina HE, mentre tutti gli altri coronavirus possiedono questo gene [13, 14].Quindi, per rilevare in modo specifico un prodotto PCR SARS-CoV1 e SARS-CoV-2, la regione di cui sopra nel gene N avrebbe dovuto essere scelta come target di amplificazione. Un test diagnostico affidabile dovrebbe concentrarsi su questa regione specifica del gene N come test di conferma. La PCR per questo gene N non è stata ulteriormente convalidata né raccomandata come gene di test dal documento Drosten-Corman, perché “non così sensibile” con la sonda originale SARS-CoV [1].

Inoltre, l’assenza del gene HE sia in SARS-CoV1 che in SARS-CoV-2 rende questo gene il controllo negativo ideale per escludere altri coronavirus. La carta Corman-Drosten non contiene questo controllo negativo, né contiene altri controlli negativi.Il test PCR nel documento Corman-Drosten quindi non contiene né un controllo positivo unico né un controllo negativo per escludere la presenza di altri coronavirus. Questo è un altro importante difetto di progettazione che classifica il test come non idoneo per la diagnosi.

6. La procedura operativa standard (SOP) non è disponibile

Dovrebbe essere disponibile una procedura operativa standard (SOP) che specifichi inequivocabilmente i parametri di cui sopra, in modo che tutti i laboratori siano in grado di impostare le stesse condizioni di prova identiche. Avere una SOP universale convalidata è essenziale, perché facilita il confronto dei dati all’interno e tra i paesi. È molto importante specificare tutti i parametri del primer in modo inequivocabile. Notiamo che ciò non è stato fatto.Inoltre, il valore Ct per indicare quando un campione deve essere considerato positivo o negativo non è specificato. Non è inoltre specificato quando un campione è considerato infetto da virus SARS-CoV. Come mostrato sopra, il test non è in grado di distinguere tra virus e frammenti di virus, quindi il valore Ct che indica la positività è di fondamentale importanza. Questo valore Ct avrebbe dovuto essere specificato nella Procedura Operativa Standard (SOP) e messo in linea in modo che tutti i laboratori che eseguono questo test abbiano esattamente le stesse condizioni al contorno. Indica una scienza difettosa che un tale SOP non esista. I laboratori sono quindi liberi di eseguire il test come ritengono opportuno, con conseguente enorme variazione. I laboratori di tutta Europa sono lasciati con una moltitudine di domande;quali primer ordinare? quali nucleotidi riempire i luoghi indefiniti? quale valore di Tm scegliere? Quanti cicli di PCR eseguire? A quale valore Ct è positivo il campione? E quando è negativo? E quanti geni testare? Devono essere testati tutti i geni o solo il gene E e RpRd come mostrato nella Tabella 2 del documento Corman-Drosten? Anche il gene N dovrebbe essere testato? E qual è il loro controllo negativo? Qual è il loro controllo positivo?

Il protocollo così come descritto è purtroppo molto vago ed errato nel suo disegno che può andare in decine di direzioni diverse. Non sembra esserci alcuna standardizzazione né un SOP, quindi non è chiaro come questo test possa essere implementato.

7. Conseguenze degli errori descritti in 1-5: risultati falsi positivi.

Il test RT-PCR descritto nel documento Corman-Drosten contiene così tanti errori di progettazione biologica molecolare (vedere 1-5) che non è possibile ottenere risultati univoci. È inevitabile che questo test generi un numero enorme di cosiddetti “falsi positivi”. La definizione di falsi positivi è un campione negativo, che inizialmente ottiene un punteggio positivo, ma che è negativo dopo aver ripetuto il test con lo stesso test. I falsi positivi sono risultati di test positivi errati, cioè campioni negativi che risultano positivi. Ed è proprio questo ciò che si trova nel documento Corman-Drosten. A pagina 6 del manoscritto PDF gli autori dimostrano che anche in condizioni di laboratorio ben controllate, con questo test si genera una percentuale considerevole di falsi positivi:

“In quattro reazioni di test individuali, è stata osservata una debole reattività iniziale, tuttavia sono risultate negative dopo aver ripetuto il test con lo stesso test. Questi segnali non erano associati a nessun virus particolare e per ogni virus con cui si è verificata una reattività positiva iniziale, c’erano altri campioni che contenevano lo stesso virus a una concentrazione più alta ma non risultavano positivi. Dati i risultati dell’ampia qualificazione tecnica sopra descritta, si è concluso che questa reattività iniziale non era dovuta all’instabilità chimica delle sonde per PCR in tempo reale e molto probabilmente a problemi di gestione causati dalla rapida introduzione di nuovi test e controlli diagnostici durante questa valutazione studia.” [1]

La prima frase di questo estratto è una chiara prova che il test PCR descritto nel documento Corman-Drosten genera falsi positivi. Anche nelle condizioni ben controllate del laboratorio Charité all’avanguardia, 4 su 310 test primari sono falsi positivi per definizione. Quattro campioni negativi sono risultati inizialmente positivi, poi sono risultati negativi al nuovo test. Questo è il classico esempio di falso positivo. In questo caso gli autori non li identificano come falsi positivi, il che è intellettualmente disonesto.

Un’altra osservazione rivelatrice nell’estratto sopra è che gli autori spiegano i falsi positivi come “problemi di gestione causati dalla rapida introduzione di nuovi test diagnostici”. Immagina i laboratori che devono introdurre il test senza tutte le informazioni necessarie normalmente descritte in una SOP.

8. Il documento Corman-Drosten non è stato sottoposto a revisione paritaria

Prima della pubblicazione formale in una rivista accademica, gli articoli scientifici e medici sono tradizionalmente certificati da “revisione tra pari”. In questo processo, i redattori della rivista ricevono consigli da vari esperti (“referees”) che hanno valutato l’articolo e possono identificare i punti deboli nelle sue ipotesi, metodi e conclusioni. In genere una rivista pubblicherà un articolo solo una volta che gli editori saranno soddisfatti che gli autori hanno affrontato le preoccupazioni dei referee e che i dati presentati supportano le conclusioni tratte nel documento. Questo processo è ben descritto anche per Eurosurveillance [16].

Il documento Corman-Drosten è stato presentato a Eurosurveillance il 21 gennaio 2020 e accettato per la pubblicazione il 22 gennaio 2020. Il 23 gennaio 2020 il documento era online. Il 13 gennaio 2020 la versione 1-0 del protocollo è stata pubblicata sul sito web ufficiale dell’OMS [17], aggiornata il 17 gennaio 2020 come versione del documento 2-1 [18], anche prima che il documento Corman-Drosten fosse pubblicato il 23 gennaio a Eurosurveillance.

Normalmente, la revisione tra pari è un processo che richiede tempo poiché almeno due esperti del settore devono leggere e commentare criticamente il documento presentato. A nostro avviso, questo documento non è stato sottoposto a revisione paritaria. Ventiquattro ore semplicemente non sono sufficienti per effettuare un’accurata revisione tra pari. La nostra conclusione è supportata dal fatto che abbiamo riscontrato un numero enorme di difetti di progettazione molto gravi, che rendono il test PCR completamente inadatto come strumento diagnostico per identificare il virus SARS-CoV-2. Qualsiasi biologo molecolare che abbia familiarità con il progetto RT-PCR avrebbe facilmente osservato i gravi errori presenti nel documento Corman-Drosten prima del processo di revisione effettivo. Abbiamo chiesto a Eurosurveillance il 26 ottobre 2020 di inviarci una copia del rapporto di revisione tra pari. Ad oggi, non abbiamo ricevuto questo rapporto e in una lettera del 18 novembre 2020,l’ECDC in quanto sede di Eurosurveillance ha rifiutato di fornire l’accesso senza fornire ragioni scientifiche sostanziali per la loro decisione. Al contrario, scrivono che “la divulgazione minerebbe lo scopo delle indagini scientifiche”. [24].

9. Autori in qualità di editori

Un ultimo punto è una delle principali preoccupazioni. Risulta che anche due autori del giornale Corman-Drosten, Christian Drosten e Chantal Reusken, sono membri del comitato editoriale di questa rivista [19]. Quindi c’è un grave conflitto di interessi che rafforza i sospetti che il documento non sia stato sottoposto a peer review. Sembra che la pubblicazione rapida sia stata possibile semplicemente perché gli autori facevano parte anche del comitato editoriale di Eurosurveillance. Questa pratica è classificata come compromettente l’integrità scientifica.

CATALOGO SOMMARIO DEGLI ERRORI TROVATI NELL’ARTICOLO

Il documento Corman-Drosten contiene i seguenti errori specifici:

1. Non esiste alcun motivo specifico per utilizzare queste concentrazioni estremamente elevate di primer in questo protocollo. Le concentrazioni descritte portano ad un aumento dei legami aspecifici e all’amplificazione del prodotto PCR, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.

2. Sei posizioni instabili non specificate introdurranno un’enorme variabilità nelle implementazioni di laboratorio del mondo reale di questo test; la confusa descrizione aspecifica contenuta nel documento Corman-Drosten non è adatta come protocollo operativo standard, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.

3. Il test non è in grado di discriminare tra l’intero virus e i frammenti virali. Pertanto, il test non può essere utilizzato come diagnostica per virus intatti (infettivi), rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2 e fare inferenze sulla presenza di un’infezione.

4. Una differenza di 10 ° C rispetto alla temperatura di annealing Tm per la coppia di primer1 (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R) rende inoltre il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.

5. Un errore grave è l’omissione di un valore Ct al quale un campione è considerato positivo e negativo. Questo valore Ct non si trova nemmeno nelle richieste di follow-up, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.

6. I prodotti della PCR non sono stati validati a livello molecolare. Questo fatto rende il protocollo inutile come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.

7. Il test PCR non contiene né un controllo positivo unico per valutare la sua specificità per SARS-CoV-2 né un controllo negativo per escludere la presenza di altri coronavirus, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare SARS-CoV-2 virus.

8. Il disegno del test nel documento Corman-Drosten è così vago e imperfetto che si può andare in dozzine di direzioni diverse; niente è standardizzato e non ci sono SOP. Ciò mette molto in dubbio la validità scientifica del test e lo rende inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.

9. Molto probabilmente, il documento Corman-Drosten non è stato sottoposto a peer review, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.

10. Troviamo gravi conflitti di interesse per almeno quattro autori, oltre al fatto che due degli autori dell’articolo Corman-Drosten (Christian Drosten e Chantal Reusken) sono membri del comitato editoriale di Eurosurveillance. Il 29 luglio 2020 è stato aggiunto un conflitto di interessi (Olfert Landt è CEO di TIB-Molbiol; Marco Kaiser è ricercatore senior presso GenExpress e funge da consulente scientifico per TIB-Molbiol), che non è stato dichiarato nella versione originale (e lo è ancora mancante nella versione PubMed); TIB-Molbiol è la società che è stata “la prima” a produrre kit PCR (Light Mix) basati sul protocollo pubblicato nel manoscritto Corman-Drosten e, secondo le loro stesse parole, hanno distribuito questi kit PCR prima della pubblicazione anche presentato [20]; inoltre, Victor Corman eChristian Drosten ha omesso di menzionare la loro seconda affiliazione: il laboratorio di test commerciale “Labor Berlin”. Entrambi sono responsabili della diagnostica antivirus in loco [21] e la società opera nel campo dei test PCR in tempo reale.

Alla luce del nostro riesame del protocollo del test per identificare SARS-CoV-2 descritto nel documento di Corman-Drosten, abbiamo identificato gli errori e gli errori intrinseci che rendono inutile il test PCR SARS-CoV-2.

CONCLUSIONE

La decisione su quali protocolli di test pubblicare e rendere ampiamente disponibili è nelle mani di Eurosurveillance. La decisione di riconoscere gli errori evidenti nel documento Corman-Drosten ha il vantaggio di ridurre notevolmente i costi umani e le sofferenze future.

Non è nel migliore interesse di Eurosurveillance ritirare questo documento? La nostra conclusione è chiara. Di fronte a tutti gli enormi difetti ed errori di progettazione del protocollo PCR descritti qui, concludiamo: non è rimasta molta scelta nel quadro dell’integrità e della responsabilità scientifica.

RIFERIMENTI

[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Rilevamento del nuovo coronavirus del 2019 (2019-nCoV) mediante RT-PCR in tempo reale. Euro Surveill. 2020; 25 (3): pii = 2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[2] Comunicazione e-mail tra il Dr. Peter Borger e il Dr. Adam Meijer: materiale supplementare

[3] Jafaar et al., Correlazione tra 3790 campioni di reazione a catena della polimerasi quantitativa-positivi e colture cellulari positive, inclusi 1941 isolati di Coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603

[4] BBC, 21 gennaio 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836 ;
Archivio: https://archive.is/0qRmZ

[5] Google Analytics – COVID19-morti in tutto il mondo: https://bit.ly/3fndemJ
Archivio: https://archive.is/PpqEE

[6] Test di laboratorio per il COVID-19 Emergency Response Technical Center, NIVD sotto
China CDC, 15 marzo 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf

[7] Manuale sulla PCR in tempo reale Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf

Nolan T, Huggett J, Sanchez E. Guida alla buona pratica per l’applicazione della PCR quantitativa (qPCR) Prima edizione 2013

[8] Trestan Pillonel et al, Lettera all’editore: rilevamento SARS-CoV-2 mediante RT-PCR in tempo reale: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/

[9] Kurkela, Satu e David WG Brown. “Tecniche di diagnostica molecolare.” Medicina 38.10
(2009): 535-540.

[10] Wolfel et al., Valutazione virologica dei pazienti ospedalizzati con COVID-2019
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x

[11] Strumento web Thermofischer Primer Dimer: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library /thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

Materiale supplementare

[12] Primer-BLAST, NCBI – National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Science. La
sequenza del genoma del coronavirus associato alla SARS. Science 300 (5624): 1399-1404.

[14] Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 isolato Wuhan-Hu-1,
genoma completo : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947

[15] Borger P. Un Coronavirus simile alla SARS era previsto, ma non è stato fatto nulla per essere preparati. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-
like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared
 ;
Archivio: https://archive.is/i76Hu

[16] Processo di valutazione / revisione del documento di Eurosurveillance: https://www.eurosurveillance.org/evaluation

[17] Raccomandazione ufficiale del protocollo e del manoscritto Corman-Drosten dell’OMS, pubblicata il 13 gennaio 2020 come versione 1.0 del documento:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus -assay-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf
 ; archivio: https://bit.ly/3m3jXVH

[18] Raccomandazione ufficiale dell’OMS per il protocollo Corman / Drosten RT-qPCR, che
deriva direttamente dalla pubblicazione Eurosurveillance, versione documento 2-1, pubblicata il
17 gennaio 2020: https://www.who.int/ docs / default-source / coronaviruse / protocol-v2-
1.pdf? sfvrsn = a9ef618c_2

[19] Comitato editoriale di Eurosurveillance, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-
assets / imgs / 2020-09-Editorial% 20Board% 20PDF.pdf
 ;
Archivio: https://bit.ly/2TqXBjX

[20] Istruzioni per l’uso LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, 11 gennaio 2020: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gene_V200204_09164154001 (1 ) .pdf

Archive, timestamp – 11 gennaio 2020: https://archive.is/Vulo5 ;
Archivio: https://bit.ly/3fm9bXH

[21] Christian Drosten e Victor Corman, responsabili della diagnostica virale al Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/
Archivio: https://archive.is/CDEUG

[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Colture virali per la
valutazione dell’infettività COVID- 19. Revisione sistematica. Revisione sistematica doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4

[23] Kim et al., The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062

[24] Risposta dell’ECDC al dott. Peter Borger, 18 novembre 2020:
materiale supplementare

[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer e team, sondaggio e tabella Primer-BLAST:
materiale supplementare

Letteratura supplementare:

Descrizione RT-PCR RKI Germania, a pagina 10 di questo link:
https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichterstattung/GBE
? DownloadsJ / JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf __ blob = p
ublicationFile

Affiliazioni dell’autore :

1) Dr. Pieter Borger (MSc, PhD), Molecular Genetics, W + W Research Associate, Lörrach, Germania 

2) Rajesh Kumar Malhotra (Artist Alias: Bobby Rajesh Malhotra ), Ex 3D Artist / Scientific Visualizations at CeMM – Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences (2019-2020), University for Applied Arts – Department for Digital Arts Vienna, Austria

3) Dr. Michael Yeadon BSs (Hons) Biochem Tox U Surrey, PhD Pharmacology U Surrey. Amministratore delegato, Yeadon Consulting Ltd, ex Chief Scientist Pfizer, Regno Unito 

4) Dr. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, Regno Unito

5) Kevin McKernan , BS Emory University, Chief Scientific Officer, fondatore di Medical Genomics, ha progettato la pipeline di sequenziamento presso WIBR / MIT per il Progetto Genoma Umano, ha inventato e sviluppato il sequencer SOLiD, ha ottenuto brevetti relativi a PCR, DNA Isolation and Sequencing, USA

6) Prof.Dr.Klaus Steger , Dipartimento di Urologia, Urologia e Andrologia Pediatrica, Andrologia Molecolare, Centro di Ricerca Biomedica dell’Università Justus Liebig, Giessen, Germania

7) Dr. Paul McSheehy (BSc, PhD), Biochimico e farmacologo industriale, Loerrach, Germania

8) Dr.Lidiya Angelova , MSc in Biology, PhD in Microbiology, Ex ricercatrice presso il National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), Maryland, USA

9) Dr. Fabio Franchi , Ex Dirigente Medico (MD) in un Reparto di Malattie Infettive, specializzato in “Malattie Infettive” e “Igiene e Medicina Preventiva”, Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Italia

10) Dr. med. Thomas Binder, Internista e Cardiologo (FMH), Svizzera

11) Prof. Dr. med. Henrik Ullrich, specialista in radiologia diagnostica, medico capo presso il Centro di radiologia del Collm Oschatz-Hospital, Germania

12) Prof.Dr.Makoto Ohashi , Professore emerito, PhD in Microbiology and Immunology, Tokushima University, Japan

13) Dott. Stefano Scoglio, B.Sc. Ph.D., Microbiologo, Nutrizionista, Italia

14) Dott.ssa Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), specialista in Medicina di laboratorio (chimica clinica), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, Paesi Bassi

15) Dr. Dorothea Gilbert (MSc, PhD), PhD Chimica Ambientale e Tossicologia. DGI Consulting Services, Oslo, Norvegia

16) Dr. Rainer J. Klement, PhD. Dipartimento di Radioterapia Oncologica, Ospedale Leopoldina di Schweinfurt, Germania

17) Dr.Ruth Schruefer, PhD, genetica umana / immunologia, Monaco, Germania, 

18) Dra. Berber W. Pieksma, medico generico, Paesi Bassi

19) Dr. med. Jan Bonte (GJ), Neurologo consulente, Paesi Bassi

20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (Biologo molecolare), specialista in PI, BDC Basilea, Svizzera

21) Dr.Kevin P.Corbett , MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Scienze sociali (Science & Technology Studies) Londra, Inghilterra, Regno Unito

22) Prof.Dr.Ulrike Kämmerer, specialista in virologia / immunologia / biologia umana / biologia cellulare, ospedale universitario di Würzburg, Germania

Contributi dell’autore:

PB: Ha pianificato e condotto le analisi e la ricerca, concettualizzando il manoscritto.

BRM: Ha pianificato e condotto la ricerca, concettualizzando le figure e il manoscritto.

MY: Ha condotto le analisi e le ricerche.

KMcK: Ha condotto le analisi e la ricerca, ha concettualizzato il manoscritto.

KS: Ha condotto le analisi e le ricerche.

PMcS: Revisione delle analisi e della ricerca.

LA: Revisione delle analisi e della ricerca.

FF: Correggere le analisi e la ricerca.

TB: Correggere le analisi e la ricerca.

HU: Revisione delle analisi e delle ricerche.

MO: Revisione delle analisi e della ricerca.

SS: Correggere le analisi e le ricerche.

MDvK: revisione delle analisi e della ricerca.

DG: Revisione delle analisi e della ricerca.

RJK: Correggere le analisi e la ricerca.

RS: Correggere le analisi e le ricerche e il manoscritto.

BWK: Revisione delle analisi e della ricerca.

RvV: Revisione delle analisi e della ricerca.

JB: Correggere le analisi e la ricerca.

KC: Correggere le analisi e la ricerca.

Regno Unito: pianificato e condotto le analisi e la ricerca, concettualizzando il manoscritto.

Altri lettori di bozze:

Saji N Hameed, Informatica ambientale, Università di Aizu, Tsuruga, Ikki-machi, Aizuwakamatsu-shi, Fukushima, Giappone

Howard R. Steen, MA Chem. Eng. Cantab, ex direttore della ricerca, Germania

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